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流感病毒基因序列變異的NGS監(jiān)測方法

流感病毒感染包括人類在內(nèi)的許多鳥類和哺乳動物,并且由這些病毒引起的感染具有重大的公共衛(wèi)生,動物衛(wèi)生和經(jīng)濟意義。甲型流感病毒(IAV)在遺傳和抗原上都極為多樣化,并廣泛分布于的野生禽類,家禽和哺乳動物以及人類中。有兩種主要的表面糖蛋白,血凝素和神經(jīng)氨酸酶,具有多種亞型。在144種可能的HA-NA亞型組合中,至少有131種已在NCBI流感病毒數(shù)據(jù)庫中從禽類中分離出來的菌株中進行了確認。對流感的監(jiān)測,快速診斷,傳播,發(fā)病機制和疫苗學(xué)的持續(xù)研究對于預(yù)防和減輕其影響至關(guān)重要。

流感研究的一個關(guān)鍵方面是檢測流感病毒的類型,亞型和基因型,并對其進行分類,特別是對于不同樣本(例如野生鳥類,家畜和人類患者)中新出現(xiàn)的病毒變異要進行監(jiān)測,預(yù)防和治療。技術(shù)進步允許開發(fā)新的方法來鑒定來自各種樣品類型的流感病毒分離株,包括基于培養(yǎng),抗體結(jié)合,血清學(xué)測定,基因擴增和基因測序方法。比較全面的檢測方法仍然是采用高通量測序技術(shù)。由于典型臨床樣品中病毒RNA的數(shù)量較低,所有這些研究都采用了病毒特異性引物和病毒特異性PCR擴增策略來捕獲目標流感序列。然而近在下一代測序(NGS)中越來越多地強調(diào)PCR引入的錯誤。目前已經(jīng)顯示常用的PCR酶,包括高保真酶,均具有10-510-6點突變/ bp /重復(fù)的錯誤率。除了特征明確的聚合酶堿基取代錯誤外,還發(fā)現(xiàn)其他錯誤同樣普遍,包括PCR介導(dǎo)的重組,模板轉(zhuǎn)換和溫度循環(huán)過程中引入的DNA損傷。使用PCR捕獲源自流感病毒RNAcDNA的另一個挑戰(zhàn)是分離的流感RNA可能已被降解,因此難以通過需要全長片段作為模板的流感通用引物進行擴增。在許多場合下,無法使用亞型特異性引物,因為樣品中流感病毒的類型或亞型是未知的。

美國NIH設(shè)計了一種針對所有流感病毒株的捕獲探針。利用所有可用的甲型,乙型和丙型流感病毒序列,獲得了用于設(shè)計通用流感捕獲探針集。但探針捕獲的前提是需要有足夠的cDNA才可以實現(xiàn),同時避免使用PCR引入的錯誤。 因此,美國NIH采用了Nugen公司的Ovation RNA-seq V2試劑盒來富集病毒的cDNA。 該試劑采用了Ribo-SPIA技術(shù),只需4.5小時,即可從500 pg-100 ng RNA中獲得高質(zhì)量的cDNA樣品。對于降解的樣本(如RIN 2.4)的樣本,同樣會給出驚喜的結(jié)果。Ovation RNA-Seq System V2以簡化的工作流程提供了更高的轉(zhuǎn)錄本覆蓋和均一的測序序列分布。 SPIA技術(shù)是取代PCR擴增的一種技術(shù),其原理是單引物的擴增, 同時擴增保證每次的模板是樣品模板,不同于PCR擴增模板可能是上一輪的擴增產(chǎn)物。 SPIA擴增產(chǎn)物無偏向,可用于基因表達差異分析,因此可呈現(xiàn)樣品的原始比列狀態(tài)。將該方法應(yīng)用于從野鳥場監(jiān)視收集的泄殖腔拭子樣品中,發(fā)現(xiàn)這些樣品中的IAV序列和亞型是傳統(tǒng)方法無法檢測到的。

隨后,NIH使用病毒靶向雜交捕獲對來自接受GMP制成的A型流感/加利福尼亞/ 04/2009H1N1)攻擊的15位志愿者和52009年大流行的自然感染流感患者的鼻洗樣本進行了深度測序。在挑戰(zhàn)病毒中發(fā)現(xiàn)了十個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位置。在攻擊患者和自然感染患者中發(fā)現(xiàn)了許多SNP位點,其中許多以前未發(fā)現(xiàn)。鑒定出的SNP和進化樹分析表明,在挑戰(zhàn)參與者和自然感染的患者中病毒的宿主內(nèi)部進化是不同的。這項研究使用PCR Free的雜交捕獲技術(shù),提供了一種準確無偏的評估方法,用于評估人體內(nèi)從統(tǒng)一的流感接種劑到宿主體內(nèi)不同病毒的進化,并與自然感染的患者進行比較。

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